Nachdem der barocke Vorgängerbau der Kirche 1795 abbrannte, begann eine langwierige Planungsphase für einen Neubau, in der unter anderem Friedrich Gilly (1772–1800) einen monumentalen Entwurf vorlegte. Dieses Projekt griff sein Schüler Karl Friedrich Schinkel (1781–1841) wieder auf, als er ab 1826 durch den preußischen König Friedrich Wilhelm III. (1770/1797–1840) mit dem Projekt betraut wurde und einen kuppelbekrönten Zentralbau entwarf. Neben den König nahm dessen Sohn Friedrich Wilhelm IV. (1795/1840–1861) bedeutenden Einfluss auf die Gestaltung des Bauwerkes. Vorerst ohne die geplante Kuppel erfolgte 1830–1837 unter der Leitung von Ludwig Persius (1803–1845) die Ausführung mit einem flachen Satteldach und vorgelagerten Portikus. 1843 begann dann die Errichtung der stadtbildbeherrschenden, aus zwei Schalen aufgebauten Kuppel, die ebenfalls Persius, nach dessen Tod Friedrich August Stüler (1800–1865) verantwortete. Aus statischen Gründen wurden dabei dem Schinkel-Bau die vier Ecktürme angefügt. Nachdem die Neuausgestaltung des Inneren vollendet war, konnte 1850 die Weihe der Kirche erfolgen, an dessen Ausführung die namhaftesten zeitgenössischen Architekten Preußens gearbeitet hatten. Im Zweiten Weltkrieg wurde der Bau stark zerstört, danach erfolgte in einem langwierigen Prozess eine zum Teil vereinfachende Wiederherstellung.

Die Ausmalung in der Apsis – an frühchristliche Vorbilder angelehnt – schuf Bernhard Wilhelm Rosendahl (1804–1846) nach einem Entwurf von Schinkel vor 1837. Zehn Jahre später kam es zu einer Neufassung und Ergänzung der Apostel- und Evangelienfiguren. Der thronende Christus darüber ist nicht mehr erhalten. Im Übergang von Gewölbe und Kuppel, den Pendentifs, befinden sich Darstellungen von Propheten des Alten Testaments, die unter der Leitung von Peter von Cornelius (1783–1867) entstanden. Der Altar aus dunklem Marmor entstand noch nach einem Entwurf von Schinkel, den Aufbau ergänzte 1850 Stüler. An der Kanzel befinden sich Zinkguss-Reliefs von August Kiß (1802–1865), die unter anderem die Bergpredigt zeigen. Die heutige Orgel mit 21 Registern auf zwei Manualen befindet sich seit 2005 in der Kirche.

Quellenangaben: Badstübner, Ernst: Stadtkirchen der Mark Brandenburg. Berlin 1983, S. 124 f., 196 f.; Dehio Brandenburg 2000, S. 779-781, http://de.wikipedia.org/wiki/Nikolaikirche_Potsdam; http://www.nikolai-potsdam.de/